227 článků s nálepkou genetika


Pondělí 8. října 2007



Pátek 5. října 2007


Rakovina plic je jedna z nejrozšířenějších smrtelných chorob. Nejvíce ohroženi jsou samozřejmě aktivní kuřáci, rakovina se ale nevyhýbá ani lidem, kteří nikdy v životě nekouřili. Na druhé straně jsou případy opravdu těžkých kuřáků, kteří přesto rakovinou neonemocní. K zodpovězení otázky, proč tomu tak je, co se s poškozenými buňkami děje a jak rakovinu včas rozpoznat, by měl přispět výzkum Dr. Jana Přibyla a jeho kolegů z Národního centra pro výzkum biomolekul s názvem ‚Diagnostika poškození DNA polyaromatickými sloučeninami použitím nanotechnologických a bioanalytických metod pro včasnou detekci karcinomu‘.

Obr 1 – příklad polyaromatického uhlovodíku: benzo(a)pyren 
Obr 1 – příklad polyaromatického uhlovodíku: benzo(a)pyren

Polyaromatické uhlovodíky jsou polutanty, které jsou obsaženy v cigaretovém kouři, ale nejen tam. Najdeme je také ve špatně spálených zplodinách, ve výfukových plynech aut nebo i v uzeném mase, takže prakticky se s nimi setká každý. V živých buňkách se aromatické uhlovodíky mohou navázat na molekuly DNA, čímž v nich způsobí strukturní změny. Většinou jsou změny takového charakteru, že určitou bázi tvořící dvoušroubovici není možné přepsat, a enzym, replikující DNA, pak poškozenou bázi vynechá. Tím dojde k posunu „kódu“ sestaveného z aminokyselin a tedy ke změně celého genu. Zatím se neví, jak je možné, že určitým lidem polyaromatické uhlovodíky „nevadí“, kdežto u jiných spustí rakovinu. Pravděpodobně se na vzniku nemoci podílí komplexní působení několika různých vlivů, mimo jiné to, jak má který člověk vyvinutou reparační schopnost.

Obr 2 – základní struktura DNA 
Obr 2 – základní struktura DNA

Na projektu se Jan Přibyl podílí s firmou Exbio Praha a.s., která si Národní centrum pro výzkum molekul vybrala ke spolupráci. Firma Exbio Praha a.s. hodlá v první fázi projektu vyvinout specifickou protilátku (po chemické stránce se jedná o protein), která se naváže na poškozená místa DNA. Vědci z Národního centra pro výzkum biomolekul pak budou vyvíjet metodu, pomocí které by se poškození DNA dalo diagnostikovat. Konkrétně budou s nově vyvinutou protilátkou vyhledávat v buňce poškozené úseky DNA, stanovovat četnost těchto úseků v biologických vzorcích, ap.

Při výzkumu Dr. Přibyl využívá dvě zcela rozdílné metody zmíněné v názvu projektu. Bioanalytické metody jsou takové metody, které pro určení analytu využívají dvou principů – princip biospecifických interakcí, kdy se molekuly analytu vážou na molekuly přídavné látky stylem „zámek-klíč“ (tj. elektrostatické síly, hydrofobní interakce, vodíkové vazby a van der Waalsovy síly), nebo značení molekul pomocí tzv. markerů.

Obr 3 – Dr. Přibyl v laboratoři AFM mikroskopie 
Obr 3 – Dr. Přibyl v laboratoři AFM mikroskopie

Pracoviště Dr. Přibyla se také pyšní tzv. AFM mikroskopem (Atomic Force Microscopy) používaným pro nanotechnologickou metodu výzkumu. Takových přístrojů je v naší republice zatím jen asi deset. Ačkoli má zařízení v názvu „mikroskop“, nejedná se o mikroskop v pravém slova smyslu, neboť AFM je přístroj, který je se zkoumanou látkou v kontaktu a k detekci slouží vzájemné elektrostatické a van der Waalsovy síly. Základem AFM mikroskopu je velmi ostrý, většinou křemíkový hrot, který na svém konci může dosáhnout šířky pouze tří atomů. Tento hrot je upevněn na ohebném nosníku a během měření se pohybuje po povrchu vzorku. Výkyvy nosníku nad povrchem jsou sledovány laserem a zaznamenávány. AFM se dá použít i v bezkontaktním módu, zvlášť v případě, kdy vzorek nechceme mechanicky poškodit, pak je nosník rozkmitáván a místo jeho výchylky se měří velikost amplitudy kmitání, která závisí na vzdálenosti mezi hrotem a vzorkem.

Obr 4 – AFM mikroskop
Obr 4 – AFM mikroskop

Metoda AFM dosahuje velmi vysokého rozlišení – pod desetinu nanometru – a můžeme s ní tedy zobrazovat i atomy. Pro běžnou praxi ale není vhodná, protože pořízení jednoho AFM mikroskopu vyjde asi na 3 milióny korun a je k němu zapotřebí speciálně vyškolené obsluhy. Bioanalytické metody jsou oproti tomu již běžně laboratorně rozšířené a navíc mají tu výhodu, že jsou všechny založené na stejném principu a pouze se pro každou molekulu nebo marker jen mírně modifikují.

Vzhledem k citlivosti AFM metody používá Dr. Přibyl AFM mikroskop k zobrazení molekul DNA. Molekuly DNA se imobilizují a pomocí protilátky značené nanočásticí se vyhledá poškozený úsek. Pod mikroskopem je pak možné sledovat, jak molekula DNA vypadá, pomocí specifického značení se najde i poškozený úsek a bude možné vyjádřit, jak se toto poškození projeví na struktuře celé molekuly, jaká je četnost tohoto výskytu, apod. Takové výsledky pak zcela jistě pomůžou lékařům pro lepší určení diagnózy, ale i mikrobiologům nebo patologům.

Obr 5 - snímek molekul DNA pořízený AFM mikroskopem 
Obr 5 - snímek molekul DNA pořízený AFM mikroskopem

Pro svůj výzkum zamýšlí Dr. Přibyl zpracovat desítky až stovky vzorků. Měly by pocházet od tří skupin lidí – lidí, kteří už rakovinou onemocněli, lidí, kteří pracují v rizikovém prostředí zatíženém kontaminací ( jako jsou gumárny, koksárny, chemičky, atd.), a nakonec by se měly zpracovat i vzorky odebrané při běžných preventivních prohlídkách. Vzorky budou pocházet z různých orgánů, nejvíce jsou ovšem zasaženy plíce, játra a ledviny.

Časově je projekt velmi náročný, protože zpracování jednoho obrázku např. pomocí AFM mikroskopu trvá 10 minut až 3 hodiny, podle zvolené rychlosti a rozlišení. Momentálně se pracuje na vývoji protilátky a připravují se vhodné metody pro diagnostiku. Projekt je plánován na roky 2006 – 2010.

Jan Přibyl, Ph.D.
Národní centrum pro výzkum biomolekul
Přírodovědecká fakulta MU
Kamenice 5, 625 00 Brno
pribyl@chemi.muni.cz


Úterý 18. září 2007